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分子克隆與質粒載體構建服務

分子克隆與質粒載體構建服務

簡要描述:
分子克隆與質粒載體構建服務是分子生物學研究中的一項重要服務,它涉及在分子水平上純化和擴增特定DNA片段,并將其插入到質粒等載體中,以便在受體細胞內進行復制和擴增。

更新時間:2024-08-06

訪問量:1058

廠商性質:其他

分子克隆與質粒載體構建服務


一、分子克隆與質粒載體構建服務實驗原理


外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中,將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種:T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸桿菌連接酶沒有的特性,即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應分為3步:T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復合物;然后,酶—AMP復合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上,使DNA腺苷化;后產生一個新的磷酸二酯鍵,把切口封起來。

DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法,為了防止載體本身的自連,可以通過(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服。

連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下,粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因此人們找到了一個折中溫度,即12-16℃,連接12-16h(過夜),這樣既可大限度地發揮連接酶的活性,又兼顧到短暫配對結構的穩定


二、實驗流程

目的DNA的擴增和純化;連接反應;電泳檢測連接產物。


三、客戶提供

樣本DNA,基因序列,試劑盒。


四、公司提供

構建好的載體,電泳膠圖,測序結果。

實驗周期:大約1-2月。




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